1. INDICAZIONI CLINICHE

La determinazione degli anticorpi anti-nucleo (ANA) in immunofluorescenza indiretta (IFI) costituisce il test di primo livello per la diagnosi di Laboratorio delle malattie reumatiche autoimmuni. In presenza di un risultato ANA-IFI positivo, un maggiore potere diagnostico e prognostico è ottenibile con la caratterizzazione delle specificità anticorpali dirette contro i diversi antigeni nucleari. La determinazione di anticorpi diretti verso i cosiddetti antigeni nucleari estraibili (ENA) è utile per la diagnosi di LES, di lupus neonatale, di sindrome di Sjögren (SS), di malattia mista del tessuto connettivo (MCTD), di polimiosite/dermatomiosite (PM/DM) e di sclerosi sistemica (SSc), con caratteristiche di sensibilità e specificità variabili (Tabelle 1 e 2).
Poiché, tuttavia, in circa l'1% dei pazienti affetti da malattie reumatiche, in particolare SS e DM/PM, il test ANA-IFI può risultare negativo (1) pur in presenza di anticorpi anti-ENA, un consistente sospetto clinico per queste particolari malattie dovrebbe giustificare comunque un'indagine di approfondimento per autoanticorpi anti-ENA (2-4).

2. TEST DISPONIBILI

Gli anticorpi anti-ENA nel siero possono essere messi in evidenza con diverse tecniche correntemente utilizzate in laboratorio: immunodiffusione doppia (IDD), contro-immunoelettroforesi (CIE), immunoenzimatica (ELISA), immuno line-blot (IB), immunodot (DB) e Westernblot (WB).

La strategia nella scelta delle tecniche e nella sequenza di utilizzo dipendono da situazioni cliniche, dalle caratteristiche del metodo, dal costo dei reagenti, dai tempi di risposta, dall'organizzazione e dall'esperienza del laboratorio. Il metodo ideale dovrebbe rispondere a criteri di sensibilità e specificità clinica, precisione ed accuratezza, facilità di esecuzione, limitato impiego di tecnologia, facile reperibilità e costo contenuto; allo stato attuale non esiste metodo in grado da solo di rispondere a tutti questi requisiti.
Infatti IDD e CIE, benchè dotati di assoluta specificità, non risultano adeguati ad applicazioni routinarie estese, risentono in larga misura dalle modalità di preparazione e di esecuzione, hanno una sensibilità soddisfacente solo nei confronti di alcuni ENA (anti-Ro/SSA) (6,7) e sono metodi qualitativi. Nonostante queste considerazioni, va ricordato che la maggior parte delle correlazioni clinico-sierologiche attualmente accettate si riferiscono a studi condotti con queste metodiche.

ELISA o altri metodi immunometrici presentano un'ottima sensibilità (8) e sono metodi quantitativi. La loro specificità è variabile e legata al tipo di antigene usato sulla fase solida e alla tecnica usata per la sua purificazione; è inoltre necessario eseguire un test per ciascun antigene da indagare (8).

IB è un metodo qualitativo, dotato di buona sensibilità e specificità, ma fornisce informazioni limitate agli antigeni selezionati e le proteine utilizzate come antigeni possono risultare modificate nella loro conformazione dalle procedure di SDS-PAGE (9).

DB, di recente commercializzazione, è un metodo qualitativo, che utilizza proteine native e risulta di facile esecuzione e interpretazione; tuttavia presenta il limite di offrire un pannello ENA limitato (10).

WB è un metodo qualitativo, fornisce un pattern completo degli anti-ENA e, in particolare, degli autoanticorpi rivolti verso antigeni rari, offre la possibilità di evidenziare anticorpi rivolti verso diversi epitopi di uno stesso antigene, ma presenta le stesse limitazioni tecniche dell'IB (10) oltre a risultare spesso di difficile interpretazione. Recenti esperienze di verifica esterna di qualità (11-14) hanno inoltre evidenziato una significativa variabilità tra i diversi metodi impiegati nei laboratori clinici.
Pertanto, considerata l'attuale affidabilità analitica dei metodi, un corretto iter diagnostico per la ricerca degli anticorpi anti-ENA non può che avvalersi di più approcci metodologici; in particolare, nel caso di un risultato negativo e in presenza di un forte sospetto clinico o in caso di debole positività con metodiche altamente sensibili come l'ELISA, è consigliato l'impiego di 2 metodi, specificando chiaramente nella refertazione la metodica impiegata e il risultato ottenuto con ciascun metodo.

In tutte le malattie reumatiche la rilevazione della concentrazione degli autoanticorpi anti-ENA non fornisce informazioni aggiuntive per lo studio del decorso e della prognosi della malattia e dell'efficacia della terapia. Il ricorso a determinazioni quantitative non è pertanto indispensabile,  con l'unica eccezione della MCTD, nella quale un alto titolo degli autoanticorpi anti-U1RNP rappresenta il principale criterio diagnostico (15). In questo caso, tuttavia, anche una positività per anti-U1RNP in due diverse determinazioni qualitative, associata a positività per ANA con pattern speckled a titolo >1:640, può risultare sufficiente per la diagnosi.

3. REQUISITI RICHIESTI

Il requisito per una corretta determinazione di anti-ENA richiede l'utilizzo di sieri di riferimento sia positivi che negativi per la messa a punto delle metodiche (5) e, per quanto riguarda le metodiche immunoenzimatiche, la costruzione di un proprio cut-off con sieri di pazienti normali suddivisi per età (> o < 40 anni) e sesso.

La varietà di autoantigeni riconosciuti dagli autoanticorpi anti-nucleo è estremamente ampia.
Nell'ottica di un corretto rapporto costo-beneficio, non è ragionevole tentare in tutti i casi l'individuazione dell'autoanticorpo specifico, ma limitare la ricerca ai 6 autoanticorpi che rivestono importanza diagnostica certa o che vengono utilizzati come criterio di classificazione.

Attualmente gli autoanticorpi con queste caratteristiche sono anti-SSA/Ro, anti-La/SS-B, anti-Sm, anti-U1RNP, anti-Scl-70 e anti-Jo-1.

TABELLA 1

Anti-Sm: altamente specifici per LES; la sensibilità clinica varia dal 15 al 30%. Titoli elevati hanno maggior significato diagnostico.

Anti-U1RNP: non specifici. Presenti nel 30-40% dei pazienti con LES; ad alto titolo costituiscono criterio diagnostico irrinunciabile per la diagnosi di MCTD.

Anti-SSA/Ro: non specifici. Nei pazienti con SS sono presenti fino al 60% se testati con immunodiffusione e fino al 90% se testati con ELISA; si associano più frequentemente a interessamento extraghiandolare. Possono inoltre essere presenti in circa il 30% dei pazienti con LES. Alti titoli in ELISA, soprattutto per anti-Ro 52, sono un fattore di rischio per lupus neonatale.

Anti-SSB/La: non specifici. Sia nei pazienti con SS che in quelli con LES sono presenti con frequenza inferiore rispetto agli anticorpi anti SSA/Ro. Si associano ad una maggior incidenza di forme cutanee, vasculite, leucopenia e linfopenia, e a lupus neonatale.

Anti-centromero: associati a SSc limitata. Sensibilità del 32% in tutti i pazienti con SSc, 57% in SSc limitata; specificità elevata.

Anti-topoisomerasi I (Scl70): associati a SSc diffusa. Sensibilità clinica variabile, a seconda del metodo, dal 35 al 70%; sensibilità analitica 94-99%. Specificità clinica elevata; specificità analitica variabile dal 70 al 99%, a seconda del metodo.

Anti-Jo-1: specifici per PM/DM. Sensibilità dal 8 al 40%. Associati ad interstiziopatia polmonare e artrite.

TABELLA 2

Ulteriori specificità anticorpali (anticorpi presenti con frequenza ridotta o di significato incerto)

Anti-PM-Scl: si associa a SSc con miopatia.
Anti-U3-RNP (fibrillarina): è presente nel 4-8% dei pazienti con SSc.
Anti-RNA polimerasi I: è più frequente nelle forme progressive di SSc.
Anti-polimerasi III: comune nella SSc.
Anti-ThTo: si associa a SSc con coinvolgimento cutaneo limitato.
Anti-proteina P ribosomiale: si associa a LES e, in particolare con maggior frequenza, alle forme con manifestazioni psicotiche.
Anti-PCNA: si associa a LES in fase attiva.

BIBLIOGRAFIA

1. Bylund DJ, Nakamura RM. Importance of detection of SS-A/Ro autoantibody screening immunofluorescence tests for autoantibodies to nuclear antigens. J Clin Lab Anal; 5: 212 ; 1991.
2. Vaile J.H. et al. Is high titre ANA specific for connective tissue disease? Clin Exp Rheum 4: 433; 2000.
3. Menard H.A. Antinuclear antibodies: the medium is the message. Clin Exp Rheum 4: 429; 2000.
4. LeMing H, Nakamura RM. Current concepts and advances in clinical laboratory testing for autoimmune diseases. Crit Rev Clin Lab Sci; 34: 275; 1997.
5. Smolen JS et al Reference sera for antinuclear antibodies. Arthritis Rheum 3:413; 1997.
6. Manoussakis MN et al. Detection of anti-Ro(SS-A) antibodies in autoimmune diseases: comparison of five methods. Br J Rheumatol; 32: 449; 1993.
7. Reichlin M, Scofield H. SS-A (Ro) autoantibodies. In: Autoantibodies. Peter JB & Shoenfeld Y, eds. Elsevier, Amsterdam, 1996; pp. 783.
8. van Venrooij WJ. Autoantigens in connective tissue disease. In: Immunology of the connective tissue diseases. Panayi GS ed. Dordrecht; Kluwer, 1994: pp. 305.
9. Stott DI. Immunoblotting and dot blotting. J Immunol Methods; 119: 153; 1991.
10. Boire G et al. Sera from patients with autoimmune disease recognize conformational determinants on the 60-kD Ro/SS-A protein. Arthritis Rheum; 34: 722; 1991.
11. Bizzaro N et al. Sensitivity and specificity of immunological methods for the detection of anti-topoisomerase I (Scl70) autoantibodies: Results of a multicenter study. Clin Chem 2000; 46:1681-5.
12. van Venrooij WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. J Immunol Methods 140: 181; 1991.
13. Charles PJ et al. The Consensus Workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases: 1989-1992. Clin Exp Rheumatol; 10: 507; 1992.
14. Bizzaro N et al. Variability between methods to determine ANA, anti-dsDNA and anti-ENA autoantibodies: a collaborative study with the biomedical industry. J Immunol Methods; 219: 99; 1998.
15. Bizzaro N et al. Variabilità analitica nella determinazione degli autoanticorpi anti-ENA. Risultati preliminari di un'esperienza di VEQ. Med Lab; 2: 161; 1998.
16. Amigues JM et al. Comparative study of 4 diagnosis criteria sets for mixed connenctive tissue diseases in patients with anti-RNP antibodies. J Rheumatol; 23: 2055; 19.

APPENDICE

ANA: anticorpi anti-nucleo
IFI: immunofluorescenza indiretta
ENA: antigeni nucleari estraibili
LES: Lupus eritematoso sistemico
SS: sindrome di Sjogren
MCTD: malattia mista del connettivo
PM/DM: polimiosite/dermatomiosite
SSc: sclerodermia
IDD: immunodiffusione doppia
CIE: controimmunoelettroforesi
ELISA: metodo immunoenzimatico in fase solida
IB: immunoblot
DB: dotblot
WB: westernblot
SDS-PAGE: elettroforesi in gel di poliacrilamide e sodiododecilsolfato