Premessa
La ditta Inova Diagnostics (San Diego, California) del gruppo Werfen, si prepara ad introdurre nel mercato un nuovo sistema analitico multiparametrico (Aptiva) per la determinazione contemporanea di anticorpi presenti nelle malattie autoimmuni. La tecnologia è del tutto originale in ambito diagnostico e si basa sull’uso di una miscela di microparticelle in sospensione, coattate singolarmente con un diverso antigene. Il sistema di rilevazione è in fluorescenza con luce LED, a lettura digitale computerizzata. Il metodo è completamente automatizzato e altamente performante per numerosità e velocità di esecuzione dei test, e troverà probabilmente ampia collocazione nei Laboratori clinici. Allo stato attuale, infatti, non esistono metodi di rilevazione anticorpale multipla altrettanto performanti e celeri nonché scevri da fonti di errore umano in quanto completamente automatizzati e caratterizzati da un sistema di lettura digitale.
Scopo dello studio
Lo scopo dello studio APTIVA-FIRMA è quello di valutare l’accuratezza diagnostica e validare il nuovo metodo multiparametrico quantitativo Aptiva per la determinazione di anticorpi nelle malattie reumatiche autoimmuni (MRA) al fine di poter introdurre sul mercato un sistema innovativo, altamente performante, preciso e celere.
Pazienti
Saranno studiati complessivamente almeno 650 pazienti con MRA, diagnosticata secondo i criteri di classificazione internazionale, di cui:
150 con lupus eritematoso sistemico (LES)
150 con sclerosi sistemica (Ssc)
150 con sindrome di Sjögren primaria (pSS)
100 con miosite autoimmune
100 con connetivite indifferenziata (UCTD) ANA-positivi
I 650 pazienti verranno arruolati nei rispettivi Centri di Reumatologia di riferimento aderenti all’iniziativa. L’elenco dei Centri partecipanti è tuttora in corso di stesura, tuttavia si stima il coinvolgimento di circa 10 Centri su tutto il territorio nazionale.
La quantità minima di siero da raccogliere è di 500 microlitri/campione. È possibile utilizzare anche campioni di siero conservati congelati. I prelievi saranno effettuati nel contesto della comune pratica clinica prevista di routine nel corso del follow-up, pertanto non verranno
effettuati prelievi extra-routine ai fini dello studio.
Come controlli, verranno raccolti:
100 campioni di siero da soggetti sani
100 campioni da soggetti con malattie infettive (HCV, EBV, lue)
100 campioni da pazienti con altre malattie autoimmuni non reumatiche (malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), tiroiditi autoimmuni, diabete di tipo 1, celiachia, epatopatie)
100 campioni da pazienti con altre malattie reumatiche non autoimmuni (fibromialgia, spondilite anchilosante, psoriasi).
Anche per quanto concerne i controlli, i campioni utilizzati saranno ottenuti da prelievi effettuati di routine secondo la comune pratica clinica, pertanto non verrà effettuato alcun prelievo extra-routine.
Per quanto riguarda l’identificazione dei campioni, ogni Centro dovrà etichettare le provette in maniera consecutiva, con una sigla (per esempio quella della propria provincia) seguita da una numerazione progressiva. I Centri reumatologici clinici appartenenti al FIRMA (Forum interdisciplinare di ricerca nelle malattie autoimmuni) che aderiranno allo studio e parteciperanno al reclutamento, dovranno indicare per ciascun campione i dati anagrafici dei
pazienti (età e sesso) e i seguenti dati clinici: diagnosi, segni e sintomi di malattia, anticorpi identificati, eventuale terapia. Un elenco dettagliato dei dati anamnestici e clinici raccolti è riportato nelle schede allegate, distinte per patologia. Tutti i dati verranno inseriti in un apposito
database.
I pazienti saranno edotti relativamente alle norme vigenti in merito alla privacy dei loro dati sensibili e verranno invitati a firmare il consenso al trattamento degli stessi.
Materiali e metodi
1. Strumentazione Aptiva: principi di funzionamento e tecnologia
Aptiva utilizza la tecnologia multiparametrica PMAT (Particle Multi-Analyte Technology), che consente la determinazione quantitativa e simultanea di un profilo di anticorpi. All’interno di tali profili sono inclusi sia parametri immunologici tradizionali, già in uso in routine nei laboratori di analisi, sia nuovi parametri non ancora utilizzati nelle indagini di laboratorio ma supportati da numerose e rilevanti pubblicazioni scientifiche.
Il sistema impiega microsfere paramagnetiche che vengono codificate in modo diverso e che sono riconosciute dal sistema con una identificazione univoca. Ciascuna tipologia di antigene viene coattato su microsfere con uno stesso codice identificativo; pertanto ogni antigene è associato solamente a determinate e specifiche microsfere paramagnetiche codificate.
Lo strumento utilizza cartucce contenente tutti i reagenti specifici per la reazione analitica, inclusa la miscela delle microsfere coattate con i vari antigeni definiti nel profilo (cartucce: Aptiva CTD IgG Essential , Aptiva CTD IgG Comprehensive e Aptiva Myositis IgG).
Lo strumento esegue automaticamente tutte le fasi della reazione multianalitica, che è pertanto contemporanea e differenziata a tutti gli antigeni del profilo.
La nuova tecnologia fluoroimmunometrica multi analitica PMAT comprende 3 fasi: incubazione del campione con il mix di microsfere coattate con antigene; dopo lavaggio viene aggiunto un anticorpo IgG coniugato (tracciante) ed incubato; segue quindi un nuovo lavaggio ed un
allineamento monostrato delle particelle paramagnetiche per la fase di lettura.
Le particelle allineate vengono differenziate e riconosciute dal sistema tramite un primo specifico LED, mentre un secondo LED consente la misura dell’intensità di fluorescenza. I dati di reazione vengono catturati digitalmente da un sofisticato sensore CCD ad elevata risoluzione e successivamente archiviati, come dati di reazione grezzi, nel database dell’analizzatore per l’eventuale calcolo e rilascio dei risultati.
L’elaborazione del risultato finale per ciascun analita avviene attraverso un avanzato sistema di imaging digitale in grado di differenziare le singole particelle e di rilevare il segnale prodotto da ciascuna particella solo quando direttamente richiesto dall’operatore e utilizzando curve di
calibrazione analita-specifiche preventivamente validate sull’analizzatore.
Per la verifica della corretta funzionalità strumentale, il sistema utilizza materiale di controllo
multiparametrico per ciascun analita testato.
2. Profili autoanticorpali
I campioni verranno centralizzati in un Laboratorio (preferibilmente del gruppo FIRMA) e testati con il nuovo sistema Aptiva per i pannelli multiparamentrici CTD Essential, CTD Comprehensive e Autoimmune Myopathy. Il pannello CTD Essential include i seguenti
antigeni: dsDNA, DFS70, RNP, Sm, Ro60, Ro52, La, Scl70, Jo1 CENP-B, Ribo-P; il pannello CTD Comprehensive include: RNA Pol III, Th/To, Ku, BICD2, PM/Scl; il pannello
Autoimmune Myopathy include: Mi-2, HMGCR, NXP2, MDA5, PL-7, PL-12, EJ, SRP, TIF1, SAE e OJ.
Tutti i campioni verranno analizzati anche per ANA con metodo in immunofluorescenza indiretta su cellule HEp-2 (Inova Diagnostics) alla diluizione di base di 1:80 nel Laboratorio di riferimento prescelto. La preparazione dei vetrini verrà eseguita in maniera automatica con il
sistema QL3000 (Inova).
In caso di discrepanza tra i risultati ottenuti tra il metodo Aptiva e il metodo ANA-IIF, come parametro decisionale verrà considerata la plausibilità del risultato con la diagnosi clinica; in casi selezionati potrà essere eseguito un test di verifica con altro metodo.
Analisi statistica
Verranno analizzate:
1. la concordanza tra ANA-IFI e Aptiva
2. Sensibilità, specificità, LR e OR di ciascun metodo.
Verrà inoltre valutata la praticabilità d’uso della nuova strumentazione e la sua migliore collocazione nell’algoritmo diagnostico delle malattie reumatiche autoimmuni.
Responsabili scientifici dello studio e coordinamento
Lo studio verrà coordinato dal Prof. Roberto Gerli (Presidente gruppo nazionale FIRMA) per la parte clinica, dal Dr. Nicola Bizzaro (Socio FIRMA) e dal Dr. Danilo Villalta (Vice-Presidente gruppo FIRMA) per la parte di diagnostica immunologica.
Tempistica
La raccolta dei campioni dovrà essere completata possibilmente entro la fine dell’anno corrente.
Consenso informato
Ciascun paziente riceverà un foglio informativo (approvato dal comitato etico di Perugia) esplicativo delle modalità di svolgimento e delle finalità dello studio. I pazienti saranno arruolati solo dopo aver fornito consenso informato scritto.
Eventuale necessità di finanziamento
Werfen/Inova ha già confermato la disponibilità a installare il primo strumento disponibile per l’Europa nel Laboratorio che verrà loro indicato dal FIRMA, e a fornire gratuitamente reagenti e materiale di consumo per l’esecuzione dei test in CLIA e in IFI. Uno dei Responsabili scientifici dello studio (Dr. Nicola Bizzaro) procederà alla stesura del contratto di collaborazione con la casa madre di Inova, San Diego, CA, di cui, qualora fosse necessario, si provvederà ad inviare una copia al CEAS di riferimento.