arrow-backarrow-downarrow-leftarrow-rightarrowbraingridmicroscopepaperclipscienceslider-arrow-leftslider-arrow-righttest

AUTOANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI (revisione gennaio 2007)

Proposta di linee guida per la determinazione di autoanticorpi anti-fosfolipidi

1. SOMMARIO

Revisioni significative ai preliminari criteri classificativi (Sapporo, 1998) (1) sono state proposte nel workshop tenutosi a Sydney il 14 Novembre 2004 prima dell’11° Congresso Internazionale sugli Anticorpi Antifosfolipidi (aPL). I risultati del gruppo di lavoro sono stati pubblicati (2).

Da questi risultati, in particolare dalla revisione dei criteri di laboratorio, deriva l’aggiornamento delle linee guida per la valutazione degli aPL da noi precedentemente pubblicata (3).

2. INDICAZIONI CLINICHE

La ricerca degli aPL come suggerito dalle principali correlazioni cliniche riportate, (4,5), dai criteri di Sapporo (1) e dalla loro recente revisione (Sydney, APL 11th International Symposium) dovrebbe essere eseguita in tutti i pazienti con sintomi che siano riconducibili ai criteri clinici classificativi (trombosi e aborti ricorrenti) nonchè, auspicabilmente, nei soggetti con altri sintomi comunque descritti in associazione con gli anticorpi ma che, a causa della loro scarsa specificità, della bassa prevalenza o della contraddittorietà dei risultati riportati in recenti pubblicazioni, sono definiti come “non-criteri” (per es. livedo reticularis, piastrinopenia, valvulopatia cardiaca etc. vedi Tab.1).

La presenza di aPL è anche uno dei criteri classificativi del lupus eritematoso sistemico (6) perciò la loro ricerca rientra nella routine di inquadramento di questa malattia. Inoltre dato che gli aPL sono riscontrati a volte nelle malattie autoimmuni sistemiche e d’organo (per es. tiroidite autoimmune) è consigliabile eseguire i test in tutte le pazienti affette da queste patologie che desiderino assumere contraccettivi orali o desiderino intraprendere una gravidanza.

Recentemente è stato anche rilevato che l’aumento della prevalenza di aPL in soggetti anziani e l’associazione tra invecchiamento e fattori di rischio cardiovascolari con eventi trombotici potrebbe causare errori di classificazione. A tale scopo è consigliato stratificare i pazienti a seconda dell’eventuale presenza di addizionali fattori di rischio trombotico quali l’età (>55 anni per gli uomini, e >65 per le donne), fattori predisponenti la malattia cardiovascolare (7), trombofilia su base ereditaria (8), malattie infettive (9,10), uso di estroprogestinici, neoplasie, immobilizzazione, interventi chirurgici etc.

3. I METODI DI LABORATORIO

• I test
I criteri di classificazione aggiornati della Sindrome da Anticorpi Antifosfolipidi (APS) indicano come significativi (e quindi da considerare fattori di rischio indipendenti) la positività del test del Lupus Anticoagulant, la dimostrazione di anticorpi anti-cardiolipina β2-dipendenti (aCL) di classe IgG o IgM a medio o alto titolo; essi introducono inoltre il dosaggio degli anticorpi anti β2-glicoproteina-I (anti-β2GPI) di classe IgG o IgM quale addizionale criterio di

laboratorio (Tab 2A).
Recenti lavori di metanalisi suggeriscono che il test degli aCL sia clinicamente significativo per valori maggiori o uguali a 40 GPL (11).

• L’interpretazione dei risultati
I pazienti vengono classificati a seconda della positività ad uno o piu’ dei 3 test di laboratorio nelle 4 distinte categorie sotto riportate:
Ia: Positività unicamente degli anticorpi anti-cardiolipina
Ib: Positività unicamente del Lupus Anticoagulant
Ic: Positività unicamente degli anticorpi anti-β2GPI
II: Presenza di più di un criterio di laboratorio, tra i 3 sopra elencati, in qualsivoglia combinazione.

Mentre per la classificazione della sindrome le 4 categorie sono da considerarsi equivalenti, è riconosciuto che la contemporanea positività di piu’ di un test caratterizza una popolazione di pazienti a maggiore rischio di eventi tromboembolici (12). Pertanto, sebbene il medico non necessariamente debba richiedere per ogni singolo paziente tutti e tre i test proposti, la loro esecuzione puo’ essere applicata al singolo caso problematico ed è fortemente consigliata nell’ambito degli studi clinici.

• Timing di esecuzione dei test
Il tempo intercorso tra la comparsa delle manifestazioni cliniche e il rilievo delle anomalie di laboratorio viene oggi considerato un punto critico per attribuire agli anticorpi un significato patogenetico. Si ritiene infatti che un evento clinico manifestatosi a più di 5 anni dal rilievo di laboratorio non possa essere considerato rilevante quale criterio classificativo per APS. In questo stesso intervallo invece il simultaneo riscontro di almeno un criterio clinico ed uno di laboratorio permette la diagnosi.
Inoltre, per considerare un paziente positivo ad uno dei 3 test inclusi tra i criteri, il dato deve essere confermato ad almeno 12 settimane di distanza mediante la ripetizione dello stesso esame. Questo periodo è stato portato da 6 a 12 settimane per rafforzare la relazione tra la manifestazione clinica del sintomo e la persistente positività del test.

• Principali raccomandazioni per l’esecuzione dei test

a) Lupus Anticoagulant (LA)

Le linee guida per la esecuzione del lupus anticoagulant (13,14) sono state delineate da un sottocomitato internazionale ad hoc (International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific Subcommittee on Lupus Anticoagulants/phospholipids dependent antibodies).  Il test, eseguito su plasma, prevede una serie di passaggi da eseguirsi in accordo con i suggerimenti sotto riportati:

• Utilizzare solo campioni di plasma con meno di 1X106/L piastrine perché la presenza di fosfolipidi ad attività procoagulante presenti in piastrine attivate o danneggiate può interferire col tempo di coagulazione misurato con il test LA.
• Verificare l’allungamento del tempo di coagulazione con almeno 2 test fosfolipidi-dipendenti. Questi test misurano l’integrità del processo coagulativo contatto-dipendente, fattore tissutale-dipendente o della via finale comune. Si consiglia di eseguire almeno 2 saggi che valutino fasi differenti del processo coagulativo in quanto nessuno dei test presenta una sensibilità pari al 100%.
• Verificare la mancata correzione del prolungamento del tempo di coagulazione (eventualmente riscontrato) con l’aggiunta di plasma normale (test di mixing) per escludere che l’attività inibitoria sia dovuta a deficit di fattori di coagulazione.
• Dimostrare (attraverso la correzione del tempo di coagulazione con l’aggiunta di fosfolipidi) che l’attività inibitoria eventualmente riscontrata dipende da fosfolipidi, (test di conferma).
• Escludere altre coagulopatie.

Nei pazienti in terapia con anticoagulanti è consigliabile soprassedere al test posticipandolo se possibile ad epoca successiva alla sospensione del trattamento. Tuttavia, sono oggi disponibili dei kit commerciali che impiegano nel test neutralizzatori di eparina (la maggior parte dei dRVVT) e che quindi possono essere utilizzati in questa categoria di pazienti. Per i soggetti in terapia con anticoagulanti orali, con INR<3.5, viene consigliato di diluire il plasma 1:2 con plasma normale prima dell’esecuzione del test (15).

b) Anticorpi anticardiolipina (aCL)

Ci si limita ad esporre alcuni punti rilevanti (16-18):

• Testare i campioni in duplicato.
• Nei metodi home-made, utilizzare per i tamponi di bloccaggio, diluizione dei sieri e lavaggio soluzioni che contengano 10% di siero bovino (fetale o adulto). In effetti, in accordo con i criteri di classificazione, già citati, il test ELISA degli aCL deve rilevare anticorpi β2GPI-dipendenti di classe IgG o IgM. L'introduzione di siero bovino anche nei tamponi di lavaggio garantisce che il livello di β2GPI si mantenga costante nel sistema durante tutta la procedura.
• Determinare i valori normali in ogni laboratorio esaminando un numero adeguato  di sieri da soggetti normali (50 o più), confrontabili per età e sesso con i pazienti. I risultati di questi esami non presentano una distribuzione normale, pertanto il calcolo del cut-off dovrebbe essere espresso in percentili. Dal momento che il metodo ELISA è molto sensibile, è consigliabile utilizzare il 99° percentile.
• Esprimere i risultati in unità internazionali (GPL o MPL ovvero µg/ml di anticorpo), introducendo in ogni test una curva di calibrazione di almeno 5 punti, creata usualmente con gli standard di Harris o con standard secondari, calibrati su questi.
• E’ consigliabile infine eseguire una valutazione semi-quantitativa dei risultati, (per intervalli), secondo lo schema: - negativo, (se sotto il cut-off), - basso positivo, (se <30 GPL/MPL); - medio positivo, (se > 30 e < 80 GPL/MPL); - alto positivo, (se > 80 GPL/MPL).

Per consentire una migliore standardizzazione è auspicabile l’utilizzo di standard costituiti da anticorpi monoclonali umani o umanizzati (HCAL e EY2C9) che dovrebbero essere distribuiti dal Center for Disease Control and Prevention (CDC) ai centri che ne faranno richiesta. Pur con i limiti degli anticorpi monoclonali utilizzati per valutare popolazioni policlonali, i risultati preliminari ottenuti suggeriscono che l’impiego di questi reagenti come periodico controllo esterno della metodica possa migliorare la stabilità dei risultati (19).
Allo stato attuale è raccomandato ai laboratori che dosano routinariamente gli aCL, di controllare periodicamente, almeno ogni 6 mesi, l’accuratezza e la riproducibilità della metodica tramite scambio di sieri con altri laboratori impegnati nel settore.

c) Anticorpi anti β2-glicoproteina-I (anti β2GPI)

Nonostante le difficoltà dovute all’utilizzo nei diversi laboratori di differenti metodologie e la scarsa standardizzazione del test, gli anticorpi anti b2GPI vengono oggi considerati un fattore indipendente di rischio per trombosi e complicanze della gravidanza (20-23).  Il test per la ricerca degli anticorpi anti b2GPI di isotipo IgG e/o IgM viene eseguito su siero oppure plasma con metodica ELISA standardizzata secondo le indicazioni raccomandate (24).

Sotto vengono riportati taluni punti ritenuti di rilevante importanza:

• Testare i campioni in duplicato;
• Determinare il valore di riferimento in ogni laboratorio esaminando un numero adeguato di sieri da soggetti normali (50 o più), confrontabili per età e sesso con i pazienti. I risultati di questi esami non presentano una distribuzione normale, pertanto il calcolo del cut-off dovrebbe essere espresso in percentili. Anche in questo caso, per la già ricordata sensibilità dei metodi ELISA, è consigliabile utilizzare il 99° percentile;
• Allo stato attuale non ci sono unità di misura riconosciute e condivise a livello internazionale, non è quindi possibile dare raccomandazioni definitive in merito all’impiego dei calibratori.  I risultati possono essere espressi in unità ottiche oppure unità arbitrarie, introducendo in ogni test una curva di calibrazione.
Anche in questo caso, gli anticorpi monoclonali HCAL e EY2C9, che reagiscono con la β2GPI, potrebbero essere impiegati per consentire una migliore standardizzazione del metodo e migliorare la stabilità dei risultati (25). E’ emerso dalle osservazioni di questi ultimi anni che è necessaria una particolare attenzione nel valutare i risultati dell’isotipo IgM sia degli aCL che degli anti-β2GPI. In effetti, specie nella zona dei bassi positivi la presenza di fattore reumatoide o di crioglobuline potrebbe dar luogo a false positività (26,27). In caso di positività isolata del solo isotipo IgM, sarebbe consigliabile segnalare questa possibilità unitamente al referto (18).

• Altri test di laboratorio disponibili

Non è ancora stato attribuito un preciso significato patogenetico agli altri anticorpi aPL e studi prospettici per valutare l’eventuale associazione di queste specificità anticorpali con specifiche manifestazioni cliniche sono in corso. Al momento pertanto, i metodi per rilevarli (anticorpi IgA anticardiolipina, anticorpi IgA anti-β2GPI, anticorpi anti protrombina, anticorpi anti fosfatidiletanolamina, anti fosfatidilserina etc) vengono classificati come test non-criterio (Tab. 2B).


BIBLIOGRAFIA

1. Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, Lockshin MD, Branch DW, Piette JC, et al. International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report of an international workshop. Arthritis Rheum 1999;42:1309-11.
2. Spiros Miyakis, Michael D. Lockshin, Tatsuya Atsumi, D. Ware Branch, Robin L. Brey, Ricard Cervera, Ronald H.W.M. Derksen, Philip G. de Groot, Takao Koike, Pier Luigi Meroni, Guido Reber, Yehuda Shoenfeld, Angela Tincani, Panayiotis G. Vlachoyiannopoulos and Steven A. Krilis. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost. 2006 Feb; 4(2):295-306.
3. Forum Interdisciplinare Per la Ricerca delle Malattie Autoimmuni (FIRMA). Linee Guida. Atti del Congresso della Società Italiana di Reumatologia. Reumatismo 2000;53:169-84.
4. Harris EN, Chan JK, Asherson RA, Aber VR, Gharavi AE, Hughes GR. Thrombosis, recurrent fetal loss, and thrombocytopenia. Predictive value of the anticardiolipin antibody test. Arch Intern Med 1986;146:2153-6.
5. Alarcon-Segovia D, Perz-Vazquez ME, Villa AR, Drenkard C, Cabiedes J. Preliminary classification criteria for the antiphospholipid sindrome within systemic lupus erythematosus. Sem Arthritis Rheum 1992;21:275-85.
6. Hochberg MC, Updating The American College Rheumatology Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 1997; 40: 1725.
7. Chobanian AV, Bakris GL, Black HR, Cushman WC, Green LA, Izzo JL, Jr., et al. Seventh report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension 2003;42:1206-52.
8. Walker ID, Greaves M, Preston FE. Haemostasis and Thrombosis Task Force, British Committee for Standards in Haematology. Investigation and management of heritable thrombophilia. Br J Haematol 2001;114:512-28.
9. Ordi-Ros J, Villareal J, Monegal F, Sauleda S, Esteban I, Vilardell M. Anticardiolipin antibodies in patients with chronic hepatitis C virus infection: characterization in relation to antiphospholipid syndrome. Clin Diagn Lab Immunol 2000;7:241-4.
10. Loizou S, Singh S, Wypkema E, Asherson RA. Anticardiolipin, anti-beta(2)-glycoprotein I and antiprothrombin antibodies in black South African patients with infectious disease. Ann Rheum Dis 2003;62:1106-11.
11. Galli M. Antiphospholipid antibodies and thrombosis: do test patterns identify the patients' risk? Thromb Res 2004;114:597-601.
12. Neville C, Rauch J, Kassis J, Chang ER, Joseph L, Le Comte M, et al. Thromboembolic risk in patients with high titre anticardiolipin and multiple antiphospholipid antibodies. Thromb Haemost 2003;90:108-15.
13. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH. Thromb Haemost 1995;74:1185-90.
14. Wisloff F, Jacobsen EM, Liestol S. Laboratory diagnosis of the antiphospholipid syndrome. Thromb Res 2002;108:263-71.
15. Tripodi A, Chantarangkul V, Clerici M, Mannucci PM. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment. Performance of dilute Russel viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA. Thromb Haemost 2002;88:583-6.
16. Tincani A, Allegri F, Sanmarco M, Cinquini M, Taglietti M, Balestrieri G, et al. Anticardiolipin antibody assay: a methodological analysis for a better consensus in routine determinations--a cooperative project of the European Antiphospholipid Forum. Thromb Haemost 2001;86:575-83.
17. Harris EN, Pierangeli SS. Revisiting the anticardiolipin test and its standardization. Lupus 2002;11:269-75.
18. Wong RC, Gillis D, Adelstein S, Baumgart K, Favaloro EJ, Hendle MJ, et al. Consensus guidelines on anti-cardiolipin antibody testing and reporting. Pathology 2004;36:63-8.
19. Tincani A, Allegri F, Balestrieri G, Reber G, Sanmarco M, Meroni P, Boffa MC. Minimal requirements for antiphospholipid antibodies ELISAs proposed by the European Forum on antiphospholipid antibodies. Thromb Res 2004;114:553-8.
20. Galli M, Luciani D, Bertolini G, Barbui T. Anti-beta 2-glycoprotein I, antiprothrombin antibodies, and the risk of thrombosis in the antiphospholipid sindrome. Blood 2003;102:2717-23.
21. Reber G, de Moerloose P. Anti-beta2-glycoprotein I antibodies-when and how should they be measured? Thromb Res 2004;114:527-31.
22. Faden D, Tincani A, Tanzi P, Spatola L, Lojacono A, Tarantini M, et al. Anti-beta2 glycoprotein I antibodies in a general obstetric population: preliminary results on the prevalence and correlation with pregnancy outcome. Anti-beta2 glycoprotein I antibodies are associated with some obstetrical complications, mainly preeclampsia-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1997;73:37-42.
23. Lee RM, Branch DW, Silver RM. Immunoglobulin A anti-beta2-glycoprotein antibodies in women who experience unexplained recurrent spontaneous abortion and unexplained fetal death. Am J Obstet Gynecol 2001;185:748-53.
24. Reber G, Tincani A, Sanmarco M, de Moerloose P, Boffa MC. Proposals for the measurement of anti-beta2-glycoprotein I antibodies. Standardization group of the European Forum on Antiphospholipid Antibodies. J Thromb Haemost 2004;2:1860-2.
25. Ichikawa K, Tsutsumi A, Atsumi T, Matsuura E, Kobayashi S, Hughes GR et al. A chimeric antibody with the human gamma1 constant region as a putative standard for assays to detect IgG beta2-glycoprotein I-dependent anticardiolipin and anti-beta2-glycoprotein I antibodies. Arthritis Rheum 1999;42:2461-70.
26. Bahar AM, Kwak JY, Beer AE, Kim JH, Nelson LA, Beaman KD, et al. Antibodies to phospholipids and nuclear antigens in non-pregnant women with unexplained spontaneous recurrent abortion. J Reprod Immunol 1993;24:213-22.
27. Spadaro A, Riccieri V, Terracina S, Rinaldi T, Taccari E, Zoppini A. Class specific rheumatoid factors and antiphospholipid sindrome in systemic lupus erythematosus. Lupus 2000;9:56-60.

PROGETTI IN EVIDENZA

  • The General Practice Guide to Autoimmune Diseases

    The development of autoimmunity and autoimmune diseases is believed to involve interactions between genes,hormones, and the environment and was labeled in 1989 as “The mosaic of autoimmunity”.

    approfondisci
  • Approccio del laboratorio analisi alla diagnostica delle malattie autoimmuni sistemiche

    Proposta di collaborazione scientifica nell'ambito della diagnostica in vitro delle malattie del tessuto connettivo.

    approfondisci
  • Approccio alla diagnostica di laboratorio delle vasculiti ANCA-associate (VAA) nei laboratori clinici italiani

    La ricerca degli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) è di fondamentale importanza per la diagnosi delle VAA. Negli ultimi anni le richieste di ANCA sono notevolmente aumentate e si sono rese disponibili nuove tecnologie e metodi analitici in grado di supportare strategie diagnostiche più efficaci.

    approfondisci
  • Protocollo Ana Reading (Progetto PARE)

    La ricerca di anticorpi anti-nucleo (ANA) è formalmente richiesta per la classificazione e la diagnosi di numerose malattie autoimmuni.

    approfondisci
  • Progetto “Italian survey on antiphospholipid antibody positive individuals” – Acronimo INSPIRE

    Il progetto si propone di migliorare la gestione dei pazienti con positività per anticorpi antifosfolipidi mediante un registro prospettico dei dati osservati a lungo termine e raccolti da laboratori centrali di strutture ospedaliere e da centri clinici coinvolti.

    approfondisci
  • Anticorpi anti-NXP-2 nella dermato-polimiosite: associazione con neoplasia e confronto tra metodiche di laboratorio commerciali con metodiche gold-standard. Studio multicentrico italiano

    Gli anticorpi anti-NXP-2 (chiamati inizialmente anti-MJ) sono degli autoanticorpi diretti contro la proteina Nuclear Matrix Protein 2, localizzata nei PML nuclear bodies, che fanno parte del gruppo degli anticorpi miosite specifici (MSA). L’antigene MJ è una proteina della matrice nucleare, chiamata NXP2/MORC3, che è coinvolta nella regolazione della senescenza cellulare p53-indotta in risposta a segnali oncogenici.

    approfondisci