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Anticorpi anti-nucleo in immunofluorescenza indiretta

Proposta di linee guida per la determinazione degli anticorpi anti-nucleo (ANA)
in immunofluorescenza diretta (IFI)

 

1. INDICAZIONI CLINICHE
La determinazione degli ANA è utile per la diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES) in accordo con i criteri classificativi dell'America College of Rheumatology (1,2).

ANA sono stati descritti in altre malattie autoimmuni sistemiche (Sclerosi sistemica [SSc], Sindrome di Sjogren [SS], mallattia mista del connettivo [MCTD], polimiosite/dermatomiosite [PM/DM] e altre.

Il termina ANA indica un gruppo di anticorpi diretti verso differenti antigeni; la caratterizzazione del singolo sistema antigene/anticorpo ha permesso l'identificazione di marker specifici per le varie malattie autoimmuni sstemiche.

La positività per ANA in IFI ha un diverso peso diagnostico per le fferenti malattie autoimmuni sistemiche ed ANA possono essere riscontrati anche in patologie non autoimmuni (tanella 1 & 2).

2. TESTI DISPONIBILI

L'immunofluorescenza indiretta (IFI) è il metodo di riferimento per la determinazione degli ANA.

Sono stati descritti altri metodi che impiegano miscele di antigeni nucleari estrattivi e/o ricombinanti da utilizzare con metodiche ELISA. Al di là della loro più facile esecuzione ed automatizzazione, questi metodi non offrono tuttavia, al momento, la garanzia di poter individuare tutte le specificità autoanticorpali possibili.

I motivi alla base della loro sensibilità ridotta rispetto all'IFI sono essenzialmente legati a due ordini di fattori:
a) la preparazione di antigeni nucleari - sia estrattivi sia ricombinanti - non permette sempre una completa riproducibilità delle molecole nella forma in cui esse sono presenti nei nuclei delle cellule e
b) non tutti i sistemi antigene/anticorpo responsabili di una positività in IFI sono stati al momento identificati (6, 7, 9-13).

3. REQUISITI RICHIESTI

I requisiti necessari per l'esecuzione di una corretta determinazione degli ANA in IFI sono:

• l'utilizzo di linee cellulari in coltura continua come substrato (più comunemente utilizzate sono le cellule della linea epiteliale di carcinoma laringeo umano - HEp2 - American Type Culture Collection  ATCC  CCL  9, 11 ). Le linee cellulari hanno, infatti, una maggiore ricchezza in materiale cromatinico rispetto alle cellule di tessuti differenziati (ad esempio sezioni di tessuto di roditore) e manifestano quindi una migliore sensibilità. L'utilizzo di linee cellulari consente l'espressione di antigeni presenti in tutte le fasi del ciclo cellulare e conseguentemente l'indicazione di specificità autoanticorpali non individuabili in sezioni di tessuto (anti-centromero, anti-fuso mitotico, anti-apparato mitotico, anti-apparato di Golgi, anti-centriolo etc.). L'utilizzo di una linea cellulare consente inoltre la determinazione di autoanticorpi specifici per antigeni nucleari specie-specifici (9-11).

• La fissazione dei substrati in acetone. Questo tipo di fissazione consente, infatti, di evitare l'eluizione di alcuni antigeni nucleari in parte idrosolubili durante i processi di lavaggio dei substrati stessi (6-11).

• L'utilizzo di antisieri anti-Ig umani coniugati con FITC (ratio Fluorocromo/Proteina = 3; ratio Attività anticorpale specifica/Concentrazione proteica > 0.1). Sono usati sia antisieri anti-Ig umane polivalenti (reattivi con IgG, IgM ed IgA) sia antisieri specifici per IgG. In corso di LES, il 96% dei sieri presenta ANA di isotipo IgG (14). L'utilizzo di antisieri specifici per IgG evita l'individuazione di ANA di classe IgM frequentemente associati con l'Artrite Reumatoide, provocati dall'assunzione di farmaci e quelli riscontrabili in soggetti con età avanzata e di scarsa utilità clinica. Tuttavia, circa il 4% dei pazienti con malattie autoimmuni sistemiche possiede ANA di isotipo IgM (6).

• La disponibilità di un sistema ottico efficiente e possibilmente calibrato con standard fluorescenti.  Per la lettura dei preparati si raccomanda l'uso di obiettivi con ingrandimento di almeno 400x.

• Modalità di refertazione: il risultato della ricerca di ANA va espresso come positività o negatività alla diluizione di screening utilizzata. Alcuni gruppi di lavoro suggeriscono che anche l'intensità dello staining debba essere segnalata nella risposta. Diluizioni di partenza < a 1/40 presentano una maggiore sensibilità ma una più bassa specificità, diluizioni > 1/160 una minore sensibilità ma una maggiore specificità (15). IL risultato può essere espresso come titolo, riportando l'ultima diluizione in cui il campione permane positivo (end point dilution). Tuttavia è raccomandazione generalmente accettata che la determinazione degli ANA abbia principalmente valore diagnostico ma che non sia altrettanto utile ai fini prognostici o di monitoraggio dell'attività di malattia.  L'esito dell'indagine va riportato non solo in termini di positività o negatività ma anche in termini di pattern di reattività secondo la terminologia al momento standardizzata: omogeneo, periferico, nucleolare, punteggiato, anti-centromero). Va tuttavia sottolineato al riguardo che non vi è un'associazione stretta tra tipologia del pattern e specificità anticorpale, l'unica eccezione al riguardo è rappresentata dagli anti-centromero. Dal momento che l'utilizzo come substrato di linee cellulari permette anche l'identificazione di uno staining citoplasmatico ed in considerazione della localizzazione non solo nucleare ma anche citoplasmatica di alcuni antigeni, un'eventuale colorazione del citoplasma dovrebbe essere riportata nel referto.

• Ciascun laboratorio dovrebbe calcolare il proprio livello di utilizzando sieri di soggetti sani della popolazione generale suddivisi per età (> o < 40 anni) e sesso (16).

• Ciascun laboratorio dovrebbe regolarmente includere un controllo positivo ed uno negativo e controllare il proprio metodo utilizzando i sieri di riferimento disponibili presso il CDC di Atlanta (AF-CDC ANA Reference Lab. Immunology Branch, CID, 1-1202 A25, Centers for Disease Control, Atlanta, GA 30333).

Tabella 1 - ANA possono essere riscontrati in malattie non autoimmuni.

Malattie infettive (ascessi cronici, tubercolosi, endocardite batterica sub-acuta, malaria, infezioni da virus di Epstein Bar etc.).

In corso di neoplasie.

In corso di terapie con farmaci noti per essere in grado di indurre questo tipo di autoanticorpi e non sempre associati con manifestazioni cliniche (procainamide, idralazina, isoniazide, cloropromazina, beta bloccanti etc.).

Parenti apparentemente sani di pazienti con malattie autoimmuni sistemiche.

L'incidenza di positività per ANA aumenta dopo i 40 anni. ANA a basso titolo sono rinvenuti in circa il 18% di soggetti normali con età > 65 anni, ma solo nel 4% della popolazione giovane (15).

Tabella 2 - PESO DIAGNOSTICO/PROGNOSTICO DELLA POSITIVITA' PER ANA (da Kavanaugh A et al. Arch Pathol Lab Med 124: 71; 2000).


BIBLIOGRAFIA

1. Tan, EN et al. The 1982 revised criteria for the classification of SLE. Arthritis Rheum 25:1271; 1982.
2. Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 40:1725; 1997.
3. Subcommittee for scleroderma criteria of the American Rheumatism Association diagnostic and therapeutic criteria committee: preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum 23: 581; 1980.
4. Vitali C et al. Preliminary criteria for the classification of Sjogren's syndrome. Results of a prospective concerted action supported by the European Community. Arthritis Rheum 36: 340; 1993.
5. Amigues JM et al. Comparative study of 4 diagnosis criteria sets for mixed connective tissue diseases in patients with anti-RNP antibodies. J Rheumatol 23:2055; 1996.
6. NCCLS: Quality assurance for the indirect immunofluorescence test for autoantibodies to nuclear antigen (IF-ANA); approved guideline. I/LA2-AVol. 16, No. 11, 1996.
7. Kavanaugh A et al. Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and test for specific autoantibodies to nuclear antigens. Arch Pathol Lab Med 124: 71; 2000.
8. Vaile JH et al. Is high titre ANA specific for connective tissue disease? Clin Exp Rheum 4: 433; 2000.
9. Feltkamp TEW et al. Antinuclear determination in daily practice. In: Kalden JR, Feltkamp TEW eds. Antibodies to nuclear antigens. Excrpta Medica, Amsterdam, 1982; pp.11.
10. Hollingsworth PN et al. Antinuclear antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB & Y. Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, 1996; pp. 74.
11. Humbel RL Detection of nuclear antibodies by immunofluorescence. In: Manual of Biological Markers of Diseases. Kluwer, Dordrecht, A3: 1-16; 1993.
12. Emlen W & O'Neill L. Comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arthritis Rheum 9: 1612; 1997.
13. Bayer PM et al. Multicenter evaluation study on a new Hep2 ANA screening enzyme immune assay. J Autoimmun 13: 89; 1999.
14. Gonzales EN, Rothfield NF. Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med 271:1333; 1966.
15. Tan EM et al. Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 9: 1601; 1997.
16. Smolen JS et al. Reference sera for antinuclear antibodies. II Further definition of antibody specificities in international antinuclear antibody reference sera by immunofluorescence and western blotting. Arthritis Rheum 3:413; 1997.


APPENDICE

ANA: anticorpi anti-nucleo
IFI: immunofluorescenza indiretta
LES: Lupus eritematoso sistemico
SSc: sclerodermia
SS: sindrome di Sjogren
MCTD: malattia mista del connettivo
PM/DM: polimiosite/dermatomiosite
ELISA: metodo immunoenzimatico in fase solida
FITC: isotiocianato di fluoresceina
LED: lupus discoide

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